Xét nghiệm PCR: Khái niệm, Phân loại, Ý nghĩa
1. Xét nghiệm PCR là gì?
Xét nghiệm PCR hay còn gọi là xét nghiệm sinh học phân tử là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985.
Xét nghiệm PCR đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học do phản ứng rất nhạy và cho kết quả đặc hiệu. Xét nghiệm PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao. Tuy nhiên kết quả cũng còn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc và việc quản lý chất lượng. Cùng một xét nghiệm nhưng có nơi cho kết quả nhạy và chính xác, nơi khác thì không có được độ nhạy bằng.
Hiện nay để thực hiện xét nghiệm PCR thường đắt tiền hơn so với các xét nghiệm thông thường khác do hầu hết hóa chất để làm phản ứng đều phải nhập ngoại và phải mua với giá cao. Chưa kể các thiết bị để làm xét nghiệm PCR cũng lên đến vài chục ngàn USD/máy. Để xét nghiệm một bệnh phẩm, thường bạn phải chi trả 8-10 USD/lần.
2. Ứng dụng trong xét nghiệm Y học
Ngày nay, xét nghiệm PCR là kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong y học. Phương pháp này thường được dùng để chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu, liên quan đến các loại virus mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được. Cụ thể xét nghiệm sinh học phân tử giúp chẩn đoán chính xác các bệnh như:
- Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1...), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).
- Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).
- Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu...)
- Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus – MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase...)
- Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.
- Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN...
- Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.
- Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 - BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin...)
- Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)..
3. Một số kỹ thuật PCR thường dùng
Sơ đồ giai đoạn của kỹ thuật PCR
3.1. Thành phần cần có của xét nghiệm PCR
Để thực hiện được một xét nghiệm PCR cần có các thành phần sau:
- ADN mẫu chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để dùng nhân bản về sau.
- Primers (đoạn ADN mồi) dài khoảng vài chục Kb để định vị điểm bắt đầu và điểm kết thúc đoạn ADN mẫu.
- DNA polymerase (enzyme đóng vai trò tổng hợp các đoạn ADN bản sao của ADN mẫu). Đây phải là loại enzyme có khả năng chịu nhiệt cao.
- Nucleotides gồm 4 loại: A, T, C và G có vai trò cấu tạo nên cấu trúc của ADN bản sao.
- Dung dịch đệm để cung cấp môi trường cho enzyme DNA polymerase hoạt động.
- Ống PCR plastic chuyên dụng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị làm xét nghiệm PCR.
3.2. Những kỹ thuật PCR thường dùng trong xét nghiệm
Để thực hiện xét nghiệm PCR, hiện nay người ta thường dùng một số kỹ thuật sau:
- PCR đơn mồi
Kiểu PCR này tương đối cổ điển, nó chỉ dùng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại cho 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất mà thôi.
- PCR đa mồi
Đây là kỹ thuật PCR dùng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại cho các trình tự mục tiêu khác nhau có trong cùng 1 mix phản ứng. Muốn tạo được phản ứng đa mồi thì các cặp mồi được mang vào sử dụng cần phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và chúng không được bắt cặp cùng hoặc bắt cặp chéo nhau.
Thêm vào đó, độ nhạy của PCR đa mồi cũng cần tương đương đơn mồi. Tuy nhiên, do điều này khó thực hiện được PCR đa mồi thường được dùng ở các tế bào nuôi cấy vì khi ấy trình tự đích sẽ có số lượng đủ lớn để không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.
- PCR tổ
Với kỹ thuật PCR tổ cần có 2 cặp mồi: 1 cặp mồi bên ngoài và 1 cặp mồi bên trong. Trong đó, cặp mồi bên ngoài tham gia PCR lần 1 trước nhằm làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích; còn cặp mồi bên trong tham gia PCR lần 2 giúp phát hiện trình tự đích. Thường thì khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích cho độ nhạy kém người ta sẽ sử dụng kỹ thuật PCR tổ.
- RT-PCR
Khi trình tự đích là RNA thì sẽ sử dụng quy trình kỹ thuật RT-PCR. Muốn vậy, trước khi PCR, cần thực hiện thêm bước dùng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA. Đây chính là giai đoạn RT.
- RT-PCR 1 bước: chỉ thực hiện RT và PCR trong 1 ống nghiệm duy nhất, các thành phần cho RT lẫn cho PCR đều chứa cả trong mix ban đầu.
- RT-PCR 2 bước: ủ RT ở 1 ống nghiệm riêng. Để thực hiện PCR, người ta sẽ cho DNA tạo thành vào ống nghiệm chứa PCR mix.
- Realtime PCR: bản chất Realtime PCR cũng là quá trình nhân bản ADN trong ống nghiệm, tuy nhiên nó có một ưu điểm vượt trội là có khả năng hiển thị kết quả ngay tại từng thời điểm (realtime) và được ứng dụng trong các xét nghiệm định lượng như định lượng virus viêm gan B, C,... Để có được những ưu điểm trên, ngoài thành phần tương tự như một phản ứng PCR truyền thống, trong phản ứng Realtime PCR còn được bổ sung các đoạn đầu dò (probe) gắn huỳnh quang, các huỳnh quang này sẽ được máy đọc thu nhận lại và báo cáo trên màn hình hiển thị.
